Il trattamento più comune per il cancro della pelle è la rimozione chirurgica della lesione. Questo richiede tempo e quasi sempre lascia una cicatrice. Un approccio alternativo è l'elettrochemioterapia in cui il tumore è esposto a un farmaco tossico dopo l'elettropermeabilizzazione 1 utilizzando impulsi elettrici nel dominio dei microsecondi. Un terzo approccio è l'elettroporazione irreversibile che uccide il tessuto trattato per necrosi risultante dalla permeabilizzazione permanente utilizzando impulsi di dominio di microsecondi con ampiezze maggiori. 2Abbiamo scoperto che se gli impulsi elettrici vengono accorciati di 1.000 volte nel dominio dei nanosecondi, sono in grado di avviare autonomamente il processo di apoptosi all'interno delle stesse cellule tumorali, provocando la lenta autodistruzione del tumore senza richiedere farmaci tossici o permeabilizzazione permanente. 3Oltre ad avviare l'apoptosi nelle cellule tumorali, i campi elettrici pulsati in nanosecondi (nsPEF) arrestano il flusso sanguigno nei capillari che lo alimentano. Questo ridotto afflusso di sangue al tumore e l'attivazione delle vie dell'apoptosi fanno sì che il tumore si riduca lentamente e scompaia in una media di 47 giorni. Questo tempo di esposizione al trattamento è di soli 180 μsec, ma abbiamo fatto una pausa di 2 secondi tra gli impulsi per essere sicuri che non ci fosse un aumento significativo della temperatura. Ciò ha comportato un tempo di trattamento totale di 10 minuti e ha provocato cicatrici scarse o assenti.
I due motivi principali per cui questi impulsi di nanosecondi sono così efficaci è che ( i ) sono abbastanza veloci da penetrare nella cellula e in tutti gli organelli; e ( ii) sono abbastanza brevi da poter utilizzare un'intensità del campo elettrico sufficientemente grande da causare la formazione di piccoli pori nelle membrane senza un riscaldamento significativo. Finché il tempo di salita dell'impulso è più veloce del tempo caratteristico di carica della membrana cellulare di circa 0,1–1 μsec, le cariche interne non avranno tempo sufficiente per ridistribuirsi per contrastare il campo imposto e penetrerà nella cellula e caricherà ogni membrana dell'organello per una durata che dipende sia dalla costante di tempo di carica della membrana plasmatica della cellula sia da quella della membrana dell'organello. Gli impulsi lunghi 300 ns sono vicini al limite superiore di questo intervallo di penetrazione e hanno il vantaggio di erogare una dose di energia efficace (0,2 J) senza riscaldare significativamente il tumore.
La generazione di impulsi unipolari ad alta tensione con una durata compresa tra 100 e 600 nsec era basata sul concetto di linee di trasmissione e linee di formazione di impulsi come descritto in dettaglio di recente. 5 Un resistore di adattamento uguale all'impedenza del generatore di impulsi è stato posizionato in parallelo con il carico in modo che l'impedenza totale garantisse l'erogazione di un singolo impulso trapezoidale ben definito attraverso il campione biologico. Abbiamo utilizzato 4 diverse configurazioni che forniscono esposizioni simili negli esperimenti qui riportati: ( i) tutti gli studi sugli animali sono stati condotti con una rete formatrice di impulsi con un'impedenza di 75 Ω. È costituito da 30 coppie di condensatori ad alta tensione e 30 induttori disposti in una configurazione Blumlein e genera un impulso ad alta tensione lungo 300 nsec con un tempo di salita di 30 ns. 4 , 5L'interruttore di chiusura consisteva in un relè a spostamento di mercurio controllato da un microcontrollore. La tensione attraverso l'oggetto è stata monitorata utilizzando una sonda ad alta tensione (P6015A, Tektronix, Beaverton, CA) e la corrente è stata misurata mediante una bobina di Pearson (modello 2877, Pearson Electronics, Palo Alto, CA). La corrente e la tensione sono state registrate simultaneamente utilizzando un oscilloscopio digitalizzatore (TDS3052, Tektronix, Beaverton, OR). Gli impulsi del campo elettrico sono stati applicati sollevando la pelle contenente ciascun tumore lontano dal topo tra 2 dita e posizionando delicatamente il tumore tra 2 elettrodi di acciaio inossidabile circolari paralleli lucidi all'estremità di un applicatore a forma di molletta. Gli elettrodi avevano un diametro di 5 mm e coprivano completamente ogni tumore con uno spazio di 1 mm tra gli elettrodi. I tumori a volte scivolavano via da questa regione mentre venivano schiacciati tra le placche, quindi gli impulsi venivano solitamente applicati in 3 gruppi di 100, a una frequenza di 0,5 Hz e gli elettrodi venivano riposizionati tra ciascun gruppo di impulsi per garantire che l'intero tumore fosse esposto al campo. (ii ) Per gli studi sul Ca 2+ intracellulare , abbiamo utilizzato un generatore di impulsi su cavo coassiale da 100 Ω linea Blumlein con un interruttore di chiusura MOSFET (DE275-102N06A, IXYS, Milpitas, CA). L'interruttore è stato attivato da un driver MOSFET (DEIC420, IXYS) che era, a sua volta, controllato da un microprocessore a 12 bit (Analog Devices ADuC 841 Microconverter®). Questo generatore di impulsi ha mostrato un tempo di salita di 7 nsec e una durata dell'impulso di 100 nsec. ( iii ) Per gli studi sulla cometa, le cellule sono state collocate in una cuvetta con elettrodi di alluminio su 2 pareti interne opposte e abbiamo utilizzato un generatore di impulsi della linea di trasmissione da 10 Ω con uno spinterometro autodistruttivo regolato dalla distanza come interruttore di chiusura. Questo generatore di impulsi ha mostrato un tempo di salita di 5 nsec e una durata dell'impulso di 300 nsec. ( iv) Per gli esperimenti di patch-clamp abbiamo utilizzato un circuito di linea di trasmissione da 50 Ω con un interruttore di chiusura MOSFET (DE275-102N06A). Il generatore di impulsi eroga un impulso di 600 nsec con un tempo di salita di 4 nsec a una coppia di elettrodi a filo di tungsteno. Il diametro del filo era di 0,1 mm e lo spazio tra loro era di 0,11 e 0,12 mm. Per comodità, il generatore di impulsi è stato attivato da impulsi TTL esterni utilizzando il software pClamp e la scheda Digidata.
Le linee cellulari di mammiferi utilizzate in questo studio sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (Manassas, VA). Le cellule di melanoma murino (B16-F10) sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (catalogo ATCC n. 30-2002) integrato con siero bovino fetale al 10% (Atlanta Biologicals S11550, Norcross, GA), 2% L -glutammina, 100 UI/ ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina e 0,25 μg/ml di amfotericina B (Cellgro/Mediatech 25-005-CI e 30-001-CI) in un pallone di coltura da 75 cm2 mantenuto a 37°C con il 5% di CO2in aria da un incubatore per colture cellulari a camicia d'acqua. Le celle utilizzate erano comprese tra i passaggi 7 e 19 e non consentivano mai di raggiungere una confluenza superiore al 75%. Gli esperimenti di patch-clamp hanno utilizzato una linea cellulare ipofisaria murina, GH3, coltivata nel mezzo F12K di Ham integrato con il 2,5% di siero bovino fetale e il 15% di siero di cavallo (Atlanta Biologicals).
I topi femmina SKH-1 senza peli sono stati iniettati sotto la pelle in 1 posizione sul dorso con 10 6 cellule B16-F10 utilizzando un protocollo approvato dalla Eastern Virginia Medical School IACUC. Se questi tumori si ulceravano, il topo veniva soppresso. Nel gruppo trattato con nsPEF, 13 topi avevano 3 mesi quando sono state iniettate cellule di melanoma e 4 topi avevano 2 mesi. Nel gruppo di controllo, 4 avevano 4 mesi, 10 avevano 3 mesi e 4 avevano 2 mesi quando sono state iniettate cellule di melanoma
Le pipette per la registrazione patch-clamp sono state prodotte in vetro borosilicato (1B150F-4, World Precision Instruments, Sarasota, FL o BF150-86-10, Sutter Instrument, Novato, CA). Sono stati tirati a una resistenza della punta di 1,5–3 MΩ utilizzando un estrattore per micropipette Flaming/Brown P-97 (Sutter).
Le esposizioni di singole cellule a nsPEF e le successive misurazioni della resistenza della membrana ( R m ) sono state eseguite in una camera con fondo di vetro (Warner Instruments, Hamden, CT) montata sul palco di un microscopio invertito. Il microscopio era un Olympus IX71 (Olympus America, Center Valley, Pennsylvania). Un coprioggetto con cellule è stato inserito nella camera riempita con un tampone da bagno a temperatura ambiente ed è stata selezionata una singola cella adatta per l'esposizione a nsPEF e la registrazione con patch-clamp. Gli elettrodi di erogazione di nsPEF e una micropipetta di vetro sono stati posizionati accanto alla cella selezionata utilizzando micromanipolatori robotici MP-285 e MP-225 (Sutter Instrument, Novato, CA).
I dati elettrofisiologici sono stati acquisiti utilizzando un amplificatore Multiclamp 700B, un convertitore AD Digidata 1322A o 1440A e il software pCLAMP10 (MDS, Foster City, CA).
Le cellule B16 sono state caricate con 5 μM Fluo-4 AM nella soluzione salina tamponata di Hank integrata con tampone HEPES 6,7 mM e glucosio 2,5 mM per 45 minuti al buio a temperatura ambiente. Il caricamento è stato eseguito a temperatura ambiente per ridurre al minimo la compartimentazione del colorante. 6 , 7 Ca 2+ extracellulareè stato chelato mediante l'aggiunta di EGTA 5 mM al tampone prima dell'applicazione di nsPEF. È stata costruita una camera dell'elettrodo coprioggetto in vetro per applicare il nsPEF alle cellule. La camera è stata fabbricata dapprima metallizzando un vetrino coprioggetto n. 1 mediante evaporazione termica di cromo e nichel, quindi modellando uno stampo galvanico di fotoresist positivo spesso 30 μm e infine elettrodeposizione da un bagno di placcatura di solfammato di nichel con un rivestimento superiore in oro per garantire la protezione biologica Compatibilità. Questo processo produce elettrodi che vengono depositati direttamente sul substrato di vetro senza strato di colla intermedio. La distanza tra gli elettrodi è di 100 μm, consentendo l'applicazione di campi elettrici fino a 100 kV/cm con un generatore di impulsi di linea Blumlein caricato a 1 kV. Cinque microlitri di cellule in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sono stati collocati nello spazio dell'elettrodo e coperti con un coprioggetto rotondo da 8 mm. Gli esperimenti sono stati eseguiti a 37°C utilizzando un riscaldatore per obiettivi per microscopio su misura. L'imaging confocale è stato eseguito con un imager confocale a disco rotante Perkin Elmer UltraVIEW montato su un microscopio invertito Olympus IX71 con un obiettivo a immersione in olio 60 × (apertura numerica di 1,42). Per prevenire l'evaporazione, il coprioggetto rotondo è stato sigillato con fluido siliconico puro (Clearco Products, Bensalem, PA) erogato da una grande siringa di plastica con uno stub luer ancorato con resina epossidica.
I tumori sono stati fissati in formalina tamponata al 10% durante la notte e processati per l'istologia. Le sezioni di tessuto in serie sono state deparaffinate e il recupero dell'antigene è stato ottenuto mediante microonde per 10 minuti in tampone citrato 0,01 M (pH 6,0). I seguenti anticorpi sono stati utilizzati per etichettare i vetrini: Bcl-2(C-2), Bad(H-168) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) La densità dei microvasi è stata identificata incubando sezioni per 1 ora con CD31 anti-topo anticorpo (M-20; Santa Cruz Biotechnology). I microarray tissutali sono stati adottati per l'omogeneità e l'analisi ad alto rendimento. Una sezione è stata colorata con ematossilina-eosina (H&E) per la diagnosi istopatologica prima dell'immunocitochimica. La percentuale di ciascuna sezione macchiata con 1 di questi anticorpi è stata determinata utilizzando Photoshop'
Le cellule di melanoma di topo B16-F10, numeri di passaggio 5-15, sono state raccolte e lavate in PBS. Centoquaranta microlitri di cellule (1 × 10 5 cellule/ml) sono stati collocati in cuvette monouso con piastra parallela, elettrodi di alluminio su 2 lati (Biosmith Biotech, distanza di 1 mm) e pulsati utilizzando parametri simili a quelli utilizzati per in vivoesperimenti descritti sopra (tipicamente, durata dell'impulso di 300 nsec, 40 kV/cm, numero di impulsi 10-100). Le cellule di controllo sono state pipettate in cuvette e mantenute in condizioni identiche a quelle cellule sottoposte a nsPEF. Dopo la pulsazione, aliquote di 10 μl di cellule sono state prelevate e miscelate con 100 μl di agarosio a basso punto di fusione al 2% in PBS (Amresco, Agarose II) a 30 ° C. Settantacinque microlitri della miscela cellulare sono stati sparsi su vetrini e lasciati gelificare a temperatura ambiente. I vetrini sono stati quindi elaborati essenzialmente come descritto nei Rif. 8 e 9. I vetrini sono stati immersi in tampone di lisi refrigerato (1,24 mM NaCl, 200 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 34 mM sarkosyl, 10 mM Triton-X 100, pH 10,0) per 1 ora. I vetrini sono stati quindi collocati in una camera per elettroforesi orizzontale, immersi in tampone per elettroforesi alcalina (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13) e tenuti a temperatura ambiente per 30 minuti. Sono stati quindi esposti a 2,5 V/cm per 30 minuti a temperatura ambiente. I vetrini sono stati risciacquati due volte in tampone di neutralizzazione in eccesso (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5), risciacquati brevemente con acqua e quindi colorati con ioduro di propidio (210 μg/ml). Le cellule sono state riprese con una fotocamera digitale Olympus DP70 utilizzando la microscopia a fluorescenza con una lampada al mercurio e un set di filtri TRITC (filtro eccitatore: 510–550 nm; 570 nm dicroico; barriera: 590 longpass). Le immagini sono state analizzate per la quantificazione della cometa utilizzando il software CometScore (TriTek Corp).
Abbiamo generato 1 melanoma in ciascuno dei 35 topi SKH-1 albini, glabri e immunocompetenti iniettando 10 6 cellule murine B16-F10 appena sotto la pelle sul dorso di ciascun animale. Entro 3 giorni, queste cellule hanno formato un melanoma con una forma discoidale di 3-4 mm di diametro e circa 1 mm di spessore che mostrava angiogenesi. Questi melanomi possono essere meglio osservati nei topi albini perché la loro pelle è traslucida. Quando la pelle contenente il tumore viene tesa su una fonte di luce, il tumore pigmentato e l'afflusso di sangue sono molto chiari. Le immagini digitali del tumore che utilizzano questa tecnica di transilluminazione con uno stereoscopio forniscono una valutazione molto accurata delle dimensioni del tumore e dell'afflusso di sangue (Fig. 1a ; giorno 0). Diciotto di questi tumori sono serviti come controlli e non sono stati trattati (Fig. 1a ). La loro continua crescita ha causato l'ulcera del 39% entro 16-21 giorni, momento in cui quei topi sono stati soppressi. La curva di sopravvivenza per i controlli (Fig. 1 d ) indica quando ciascuno doveva essere soppresso e solo 3/18 erano ancora vivi 6 mesi dopo l'iniezione di cellule di melanoma. I melanomi avevano smesso di crescere in questi 3 controlli ma era ancora presente melanina residua.
Risposte tumorali a nsPEF. ( a ) Transilluminazione e viste superficiali di un melanoma nel topo 219 che ha risposto con remissione completa dopo un singolo trattamento di 300 impulsi (40 kV/cm, 300 nsec) il giorno 0. L'asterisco indica il giorno in cui è stato applicato nsPEF e il le foto adiacenti sono state scattate poco dopo il trattamento con nsPEF. Le cellule di melanoma coltivate sono state iniettate sotto la pelle 3 giorni prima che questa immagine fosse presa e l'angiogenesi è già evidente. I capillari vicino al tumore iniziano a rompersi dopo il trattamento con nsPEF. Per confronto, di seguito è mostrato 1 dei tumori di controllo non trattati. La barra da 2 mm nelle immagini in alto si applica a tutti i fotogrammi sottostanti. ( b) Il topo 180 è tipico di 10 melanomi che hanno mostrato una remissione totale del tumore dopo 2 trattamenti con nsPEF. Il restringimento del melanoma è documentato mediante transilluminazione e fotomicroscopia a luce riflessa dopo trattamenti di 600 impulsi (40 kV/cm, 300 ns) il giorno 0 e 300 impulsi il giorno 14. Il tumore non si è ripresentato fino al giorno 169 quando il topo 180 è stato soppresso. Ciascuna coppia di immagini è stata scattata il giorno successivo al trattamento con nsPEF indicato dai numeri a sinistra. Le coppie di immagini del giorno 0 sono state acquisite prima (0) e dopo (0*) 300 impulsi di 40 kV/cm, 300 nsec. Il tumore non si è ripresentato fino al giorno 169 quando il topo 180 è stato soppresso. ( c) Il topo 205 è tipico di 3 topi che hanno mostrato una remissione totale del tumore dopo 3 trattamenti con nsPEF. La riduzione del melanoma è documentata mediante transilluminazione e fotomicroscopia a luce riflessa dopo trattamenti di 300 impulsi (40 kV/cm, 300 nsec) nei giorni 0, 18 e 31. Ciascuna coppia di immagini è stata scattata nel giorno indicato dalla colonna all'estrema sinistra. Nessuna recidiva del tumore si è verificata durante il giorno 158 quando il topo 205 è stato soppresso. L'asterisco indica i giorni in cui è stato applicato nsPEF. ( d) Curva di sopravvivenza per 17 topi trattati con nsPEF e 18 controlli non trattati con 1 melanoma ciascuno. Tutti i 17 topi trattati hanno mostrato una remissione completa del tumore senza recidiva per 150 giorni prima dell'eutanasia. Uno di questi topi è stato soppresso il giorno 130 a causa di una perdita di peso del 20% in una settimana, ma non ha mostrato metastasi ai polmoni o al fegato. Un secondo topo trattato è stato soppresso il giorno 144 a causa di un'infezione oculare. I controlli sono stati soppressi quando i tumori si sono ulcerati.
Abbiamo trattato 17 dei melanomi con 1-3 applicazioni di 300 o 600 impulsi elettrici (40-50 kV/cm, 70-90 A, 300 nsec, 0,5 Hz). Abbiamo dimostrato in precedenza che questo trattamento di soli 90-180 μsec di tempo totale di esposizione al campo non riscalda il tumore più di 3°C, ma è sufficiente a far sì che il tumore si riduca del 90% entro 2 settimane. 4 Il nostro obiettivo qui era determinare se questi melanomi potessero essere completamente eliminati, senza recidive, utilizzando solo 1-3 trattamenti nsPEF.
Il melanoma del topo 219 era 1 dei 4 melanomi che hanno risposto a un singolo trattamento con nsPEF con remissione completa (Fig. 1a ) . Per ogni giorno indicato dopo il trattamento, vengono mostrate sia le immagini di transilluminazione che quelle di luce riflessa. Si noti che i capillari che alimentano il tumore iniziano a rompersi dopo il trattamento (0*) e sono completamente scomparsi entro il giorno 6. Entro il giorno 29, anche il tumore era sostanzialmente scomparso e non si è ripresentato nei 144 giorni in cui lo abbiamo seguito prima dell'eutanasia dell'animale . Abbiamo osservato un decorso temporale simile per gli altri 3 animali i cui tumori sono scomparsi dopo un singolo trattamento con nsPEF.
Abbiamo fotografato ogni tumore ogni 2 o 3 giorni per determinare se stava ricominciando a crescere. Una volta rilevata la ricrescita, abbiamo trattato il tumore con altri 300 impulsi utilizzando gli stessi parametri descritti sopra. Il melanoma di topo 180 (Fig. 1b ) è tipico di 10 dei 17 tumori che hanno risposto a 2 trattamenti nsPEF con remissione completa. Il confronto delle dimensioni del melanoma nei giorni 11 e 13 ha suggerito una possibile ricrescita, che era ancora più chiara il giorno 14, quindi quel giorno abbiamo trattato nuovamente il tumore. Due settimane dopo, il tumore era appena visibile e nessuna recidiva è stata rilevata entro il giorno 169 quando abbiamo soppresso l'animale. In alcuni degli animali è stato possibile rilevare una piccola macchia di pigmento residuo, ma non è cambiata dopo mesi di osservazione e l'analisi istologica ha confermato che non erano presenti cellule tumorali.
Tre dei 17 melanomi hanno ripreso a crescere dopo 2 trattamenti, quindi a questi è stato somministrato un terzo trattamento con nsPEF (M205, Fig. 1 c ). Tutti questi melanomi hanno mostrato una remissione completa dopo il terzo trattamento con nsPEF e non si sono ripresentati.
La Figura 1 illustra i cambiamenti nelle dimensioni del melanoma durante i tempi di trattamento con nsPEF. Presentiamo anche una documentazione fotografica più completa per altri 3 melanomi trattati con nsPEF nella Figura 2 . Tutti i melanomi trattati con nsPEF si riducono in superficie del 90% in media entro 2 settimane.
Microfotografie di 3 melanomi prese nel giorno indicato per ciascuna colonna dopo il trattamento con nsPEF. Le righe sono raggruppate in coppie abbinate con l'immagine in alto della coppia che rappresenta la vista della superficie e l'immagine in basso che è la vista della transilluminazione del tumore. Tutte le immagini sono state scattate con lo stesso ingrandimento indicato dalla barra della scala nell'immagine in alto a sinistra. Il numero dell'animale è mostrato a sinistra di ogni coppia raggruppata. I topi 183 e 181 sono stati trattati il giorno 0 con 600 impulsi (45 kV/cm, 300 nsec di lunghezza) e nuovamente il giorno 18 con 300 impulsi. Il topo 204 è stato trattato solo una volta al giorno 0 con 300 impulsi (40 kV/cm, 90 A, 300 nsec) e il tumore ha mostrato una remissione totale dopo questo singolo trattamento. La barra di scala nella foto in alto a sinistra si applica a tutte queste immagini. I segni del tatuaggio rosso sono stati usati per indicare la posizione originale del tumore.
Abbiamo identificato diversi bersagli cellulari influenzati da questi impulsi elettrici ultrabrevi tra cui il flusso sanguigno tumorale, la conduttanza di membrana, il Ca 2+ intracellulare , la frammentazione del DNA, la rottura dei microvasi e l'inizio dell'apoptosi.
Le immagini di transilluminazione mostrano chiaramente che i vasi sanguigni che alimentano questi tumori prima della pulsazione scompaiono entro un giorno dalla pulsazione (Fig. 1 e 2 ). Questa interruzione del flusso sanguigno al tumore sollecita queste cellule in rapida divisione e molte necrosi. Il resto delle cellule tumorali mostra l'apoptosi come mostrato di seguito. C'è anche una riduzione dei microvasi nel tumore come discusso di seguito (Figg. 7 e e 7 f ).
Abbiamo utilizzato patch clamp a cellule intere per misurare i cambiamenti di conduttanza della membrana plasmatica in una linea cellulare ipofisaria murina, GH3, risultante dall'esposizione a campi elettrici pulsati di nanosecondi e abbiamo rilevato "nanopori" unici generati nella membrana plasmatica dopo l'esposizione a nsPEF. Li chiamiamo nanopori perché i coloranti impermeabili alla membrana, come il tripan blu o lo ioduro di propidio, non li attraversano a differenza dei pori generati dall'elettroporazione classica (Fig. 3 b e 3 c). Sorprendentemente, questo aumento non è dovuto alla formazione di un poro non specifico nella membrana. Se questi nanopori fossero semplicemente buchi, la loro caratteristica IV sarebbe una linea retta, lineare a qualsiasi tensione e che attraversa l'ascissa a o vicino a 0 mV. La conduttanza effettiva è molto diversa. C'è una buona quantità di corrente interna a potenziali negativi, ma nessuna corrente positiva (verso l'esterno) a potenziali positivi (Fig. 4 d ). Quindi, i nanopori mostrano una rettifica verso l'interno insieme all'inibizione del K + verso l'esterno voltaggio-dipendentecorrente a potenziali di membrana positivi. Questi comportamenti distinguono chiaramente l'aumento di permeabilità derivante dall'applicazione di nsPEF da quello risultante dall'applicazione di impulsi molto più lunghi utilizzati per l'elettroporazione classica. Altre due importanti caratteristiche dell'aumento della permeabilità indotto da nsPEF sono che è di lunga durata e aumenta con l'intensità del campo. La conduttanza della membrana cellulare intera misurata 2-3 minuti dopo l'esposizione a un singolo impulso di 2,4 o 4,8 kV/cm ha superato i valori di controllo rispettivamente di 4-5 volte e circa 10 volte. Queste ampiezze di impulso inferiori sono state scelte perché generavano nanopori senza disturbi elettronici al computer patch-clamp.
Mancanza di assorbimento di ioduro di propidio (PI) dopo l'esposizione a nsPEF. Le cellule GH3 sono state esposte a un treno di 2 Hz di dieci impulsi da 600 nsec a 4,2 kV/cm nel mezzo contenente 20 μg/ml PI (altri componenti, mM: 135 NaCl, 5 KCl, 2 MgCl 2 , 10 HEPES e 10 glucosio) . Le immagini sono state catturate immediatamente prima ( a ) e 300 secondi dopo l'esposizione ( b ). Pannello di destra: canale di fluorescenza PI. Pannello di sinistra: fluorescenza PI sovrapposta a un'immagine DIC. L'esposizione ha causato cambiamenti morfologici minori (rigonfiamento, blebbing, granulazione), ma nessun assorbimento di PI. ( c) Controllo positivo: stesse cellule 20 secondi dopo la permeabilizzazione della membrana mediante aggiunta di digitonina (0,1%). Barra di calibrazione: 10 μm. Si noti che questa esposizione a nsPEF era molto più intensa di quanto richiesto per un profondo effetto sulla conduttanza elettrica della membrana plasmatica ( ad esempio , Fig. 3 d ). Questo risultato è stato costantemente osservato in più di 6 esperimenti.
Cambiamenti nella conduttanza elettrica della membrana plasmatica risultanti da un impulso elettrico di 600 nsec. ( a ) Correnti a cella intera in una cella GH3 suscitate da passi di tensione da -100 a +100 mV (mostrati in c ) 20 secondi prima dell'esposizione nsPEF. La pipetta patch è stata riempita con la soluzione extracellulare contenente (mM) 140 Cs-acetato, 5 Cs-EGTA, 4 MgCl 2 e 10 HEPES. ( b ) Registrazione dalla stessa cella 10 sec dopo un singolo impulso di 600 nsec a 2,4 kV/cm. L'orientamento del nsPEF applicato era perpendicolare all'asse dell'elettrodo patch in modo che l'elettrodo non interferisse con l'effetto del campo elettrico sulla cellula. ( d). Curve corrente-tensione corrispondenti ad A e B. Notare il profondo aumento della corrente media interna e del "rumore" a tensioni transmembrana negative e la mancanza di variazioni a tensioni positive. Le celle esposte potevano riprendersi completamente, ma il processo richiedeva in genere diversi minuti (dati non mostrati).
Abbiamo ripreso i cambiamenti intracellulari di Ca 2+ in cellule B16-F10 in coltura caricate con Fluo-4AM in risposta a nsPEF su un microscopio confocale a disco rotante (PerkinElmer Ultraview, Waltham, Massachusetts). Il Ca 2+ intracellulare è aumentato immediatamente dopo l'applicazione di nsPEF a causa sia del rilascio dai depositi intracellulari sia dell'afflusso di Ca 2+ attraverso la membrana plasmatica. Chelando il Ca 2+ extracellulare con EGTA 5 mM, abbiamo determinato che il 45% della variazione totale di Ca 2+ è dovuto al rilascio dalle riserve intracellulari (Fig. 5 ). Le cellule recuperate da questo aumento di Ca 2+ entro 90 secondi a 37°C (riquadro, Fig. 5). Abbiamo calcolato la media del segnale di fluorescenza da 10 a 20 cellule prelevate da più campi visivi e in giorni diversi per ottenere i dati illustrati nella Figura 5 . Poiché il nostro trattamento del tumore al melanoma ha esposto le cellule tumorali a 1 impulso ogni 2 secondi, il Ca 2+ intracellulare sarebbe stato elevato per 10 minuti durante un'esposizione di 300 impulsi.
Variazioni medie di Ca 2+ intracellulare in 10-20 cellule B16-F10 caricate con Fluo-4AM quando pulsate ai tempi contrassegnati dalle frecce (40 kV/cm, 100 nsec) a 37°C. La curva superiore rappresenta l'aumento medio di Ca 2+ nel mezzo normale, la curva centrale rappresenta l' aumento medio di Ca 2+ intracellulare nel mezzo privo di Ca 2+ (5 mM EGTA) e la curva più bassa rappresenta la fluorescenza cellulare media quando non sono stati applicati impulsi. Invece di tracciare tutti i SEM, viene tracciato solo il SEM più grande in ciascuna regione della curva. La figura nel riquadro mostra la variazione di Ca 2+ in 1 cella innescata da un singolo impulso di 100 nsec di 40 kV/cm in terreno privo di Ca 2+ .
Poiché la picnosi dei nuclei delle cellule tumorali era evidente nelle sezioni istologiche dei tumori fissi non appena 10 minuti dopo l'esposizione a nsPEF, 4 abbiamo utilizzato il test della cometa per esaminare la frammentazione del DNA. Abbiamo scoperto che la frammentazione si verifica molto rapidamente dopo l'applicazione di nsPEF e il grado di frammentazione aumenta con il numero di impulsi (Fig. 6 ). Abbiamo osservato questa frammentazione in risposta a nsPEF di diverse larghezze di impulso (60, 100 e 300 nsec) e osservato una certa riparazione del DNA se abbiamo ritardato la permeabilizzazione delle cellule per il test della cometa per un'ora (dati non mostrati). Troviamo che il grado di frammentazione del DNA in vitro è linearmente proporzionale alla radice quadrata del numero di impulsi Figura 6 b. Ciò può essere correlato alla nostra osservazione che 1 e 10 impulsi hanno scarso effetto sui tumori, ma 100 impulsi innescano fortemente l'apoptosi. 4
La frammentazione del DNA è evidente dopo l'applicazione di nsPEF utilizzando il test Comet con cellule B16 in vitro . ( a ) Dopo l'applicazione di impulsi di 40 kV/cm lunghi 300 nsec utilizzando il numero di impulsi indicato nell'angolo in alto a sinistra di ogni fotogramma, si verifica la frammentazione del DNA come indicato dalle code delle comete nella figura. ( b ) La quantificazione della fluorescenza dello ioduro di propidio ci permette di stimare la percentuale di DNA totale nella coda della cometa. Quando viene tracciata rispetto alla radice quadrata del numero di impulsi, viene rivelata una dipendenza lineare che prevede la frammentazione del DNA al 100% quando le cellule sono esposte a 100 impulsi. La linea retta è un adattamento dei minimi quadrati ai 4 punti dati e le barre di errore rappresentano il SEM con il numero di celle mediato per ogni punto stampato accanto ad esso.
Bcl-2 è una famiglia di proteine coinvolte nella risposta all'apoptosi. Alcune di queste proteine (come Bcl-2 e Bcl-XL ) sono antiapoptotiche, mentre altre (come Bad , Bax o Bid ) sono proapoptotiche. La sensibilità delle cellule agli stimoli apoptotici può dipendere dall'equilibrio delle proteine Bcl-2 pro e antiapoptotiche . Abbiamo studiato il coinvolgimento di Bcl-2 e Bad utilizzando l'immunoistochimica su sezioni di tumori sia trattati con nsPEF che non trattati. Abbiamo osservato una diminuzione media del 74% nell'etichettatura antiapoptotica di Bcl-2 confrontando 9 tumori trattati con nsPEF con 9 tumori non trattati (Fig. 7). Al contrario, l'etichetta apoptotica, Bad , è aumentata in media del 320% ( n = 8 trattati e 8 non trattati). Entrambi questi cambiamenti suggeriscono che nsPEF avvia l'apoptosi nelle cellule tumorali in vivo .
Immunocitochimica dei tumori trattati con controllo e nsPEF (300 impulsi, 40 kV/cm) utilizzando anticorpi contro Bcl-2 , Bad e CD31. ( a ) Controllo del tumore marcato con anticorpi contro Bcl-2 ; ( b ) anticorpi anti -Bcl-2 marcati con tumore trattato con nsPEF 1 settimana dopo il trattamento con nsPEF; ( c ) controllare il tumore marcato con anticorpi contro Bad ; ( d ) tumore trattato con nsPEF marcato con anticorpi contro Bad 1 settimana dopo il trattamento con nsPEF; ( e ) tumore di controllo marcato con antigene di cellule anti-endoteliali (CD31); e ( f) Tumore trattato con nsPEF marcato con anticorpi contro CD31 una settimana dopo il trattamento con nsPEF.
La crescita del tumore dipende da un aumento locale della vascolarizzazione, che richiede la formazione di nuovi capillari in un processo noto come angiogenesi. Le cellule endoteliali che formano capillari possono essere rilevate con anticorpi contro il marcatore delle cellule endoteliali, CD31. 10 Abbiamo riferito in precedenza che nsPEF interrompe il flusso sanguigno verso melanomi più grandi sulla base dei dati del power Doppler da ultrasuoni ad alta risoluzione, ma quella tecnica non è in grado di rilevare i microvasi. 4 Qui, abbiamo utilizzato l'immunocitochimica per rilevare la densità delle cellule endoteliali in entrambe le sezioni trattate con nsPEF e non trattate da 5 diversi melanomi e abbiamo trovato una riduzione media del 92% nell'espressione di CD31 nei tumori trattati con nsPEF (Figg. 7 e e 7 f). Ciò suggerisce che la microcircolazione ai tumori trattati è gravemente ridotta e questo dovrebbe portare a necrosi e restringimento del tumore.
L'uso di nsPEF per eliminare i tumori della pelle è un nuovo approccio che presenta diversi importanti vantaggi rispetto alle terapie convenzionali. È molto veloce, efficace al 100% e provoca cicatrici cutanee minime avviando percorsi di apoptosi in cui il tumore si autodistrugge lentamente. Altre due terapie che hanno utilizzato campi elettrici sono l'elettrochemioterapia e l'elettroporazione irreversibile. Il primo consente l'introduzione di farmaci tossici nel tumore mediante elettroporazione e il secondo utilizza impulsi molto più lunghi (100 μsec) di 2,5 kV/cm di ampiezza per permeabilizzare le cellule in modo irreversibile per causare necrosi. 2 , 11Entrambi questi approcci sono fondamentalmente diversi dall'uso di nsPEF. Sebbene nsPEF causi una certa necrosi riducendo drasticamente l'afflusso di sangue al tumore, gran parte dell'autodistruzione comporta l'apoptosi con conseguente riassorbimento del tumore in una media di 47 giorni. Questa eliminazione molto più lenta del tumore si traduce in una minore formazione di cicatrici e nessuna recidiva del tumore, il che è un grande vantaggio rispetto all'elettroporazione irreversibile, che uccide solo per necrosi.
Un'altra terapia che utilizza campi elettrici, tipicamente nella banda delle radiofrequenze, è l'ipertermia. Questo approccio uccide il tumore riscaldandolo a temperature superiori a 42°C per diversi minuti. Poiché i tessuti conducono abbastanza bene il calore, è impossibile riscaldare esclusivamente il tumore senza trasferire calore ai tessuti che sono in contatto con esso. Un netto vantaggio di nsPEF rispetto all'ipertermia è la capacità di localizzare più nettamente i tessuti bersaglio perché solo le cellule situate tra gli elettrodi sono esposte a nsPEF. Un ulteriore vantaggio è il tempo di trattamento molto più breve per nsPEF. Sebbene abbiamo utilizzato un tempo di trattamento di 10 minuti (0,5 Hz) per essere certi di non riscaldare il tumore a più di 3°C, come documentato nel nostro precedente articolo, 4l'aumento della temperatura del tumore si attenua dopo i primi 2 minuti di applicazione dell'impulso. Pertanto, è probabile che si possano utilizzare frequenze di applicazione dell'impulso più elevate senza significativi aumenti di temperatura e ciò potrebbe ridurre sostanzialmente il tempo totale di trattamento.
In che modo il trattamento con nsPEF porta all'apoptosi e alla frammentazione del DNA? Diversi studi precedenti su cellule in vitro hanno fornito prove molto forti che l'applicazione di nsPEF innesca l'apoptosi 12 , 13 e l'aumento del Ca 2+ 14 - 18 intracellulare nelle cellule Jurkat, HL-60 e cromaffini. Questi studi precedenti sono stati tutti condotti a temperatura ambiente, mentre quelli qui riportati sono stati condotti a 37°C. A temperatura ambiente, potremmo prevedere che il recupero dall'aumento di Ca 2+ sarebbe più lento a causa della cinetica più lenta delle pompe di Ca 2+ . Questo sembra essere il caso delle cellule HL-60 e Jurkat, ma le cellule cromaffini in realtà si riprendono più velocemente. 17Un'altra caratteristica interessante delle cellule cromaffini è che la maggior parte del Ca 2+ entra dall'esterno piuttosto che dalle riserve interne.
L'applicazione di NsPEF ai melanomi in vivo innesca anche l'apoptosi e (Fig. 7 ) ma in aggiunta ha altri effetti, come la riduzione del flusso sanguigno al tumore e l'aumento del Ca2+ intracellulare . Entrambi questi ultimi cambiamenti sono segnali importanti per l'inizio della morte delle cellule tumorali. Se il Ca 2+ intracellulare rimane alto per diversi minuti, può avviare diverse cascate metaboliche che porteranno alla morte cellulare e alla frammentazione del DNA. 19 , 20 La formazione di nanopori porta ad un aumento del Ca 2+ intracellulare, e sia l'intensità del campo elettrico che il numero di impulsi influenzano questo aumento di permeabilità. Maggiore è il numero di impulsi e il campo elettrico, maggiore sarà l'aumento della permeabilità della membrana plasmatica 21 - 23 che porterà ad un aumento duraturo del Ca 2+ intracellulare .
Questa terapia nsPEF è stata utilizzata anche per trattare i tumori della pelle da un altro gruppo della University of Southern California. 24 Lo hanno trovato efficace contro i tumori pancreatici che si sviluppano da cellule iniettate sotto la pelle del topo, nonché per un singolo caso di carcinoma basocellulare umano che ha mostrato una remissione completa dopo 1 trattamento con nsPEF con pochissime cicatrici (200 impulsi, 20 nsec di lunghezza, 43 kV/cm). Ciò suggerisce che questa nuova terapia, che si è dimostrata molto efficace per il trattamento del cancro della pelle del topo, potrebbe essere altrettanto efficace sugli esseri umani.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Air Force Office of Scientific Research, BioElectroMed Corp., un dono di Mr. Frank Reidy e fondi interni del Frank Reidy Research Center for Bioelectrics presso la Old Dominion University.