VOLUME 82 , 104124 ,01 AGOSTO 2022
08 luglio 2022DOI:
https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104124
Riepilogo
Sfondo
Le diete a digiuno intermittente o a restrizione calorica (CR) forniscono vantaggi antinfiammatori e neuroprotettivi nei modelli di sclerosi multipla (SM); i dati sugli esseri umani sono scarsi.
Metodi
Abbiamo condotto uno studio sull'alimentazione randomizzato controllato di diverse diete CR in 36 persone con SM per 8 settimane. I partecipanti sono stati randomizzati a 1 di 3 diete: 1) una dieta di controllo, in cui il partecipante ha ricevuto il 100% del proprio fabbisogno calorico 7 giorni alla settimana, 2) una dieta CR giornaliera, in cui il partecipante ha ricevuto il 78% del proprio fabbisogno calorico il suo fabbisogno calorico 7 giorni a settimana, o 3) una dieta CR intermittente, in cui il partecipante ha ricevuto il 100% del proprio fabbisogno calorico in 5 giorni a settimana e il 25% del proprio fabbisogno calorico 2 giorni a settimana (cioè, una dieta in stile “5:2”). La metabolomica non mirata è stata eseguita su campioni di plasma alle settimane 0, 4 e 8 presso Metabolon Inc (Durham, NC). La citometria a flusso di cellule mononucleate del sangue periferico crioconservato alle settimane 0 e 8 è stata utilizzata per identificare CD3
+ ;CD4
+ (CD4
+ ) e CD3
+ ;CD4
− (come proxy per CD8
+ ) sottoinsiemi di cellule T che includono memoria effettore, memoria centrale e cellule naïve.
Risultati
31 (86%) hanno completato il processo. Nel tempo, gli individui randomizzati a CR intermittenti hanno avuto riduzioni significative della memoria dell'effettore (per CD4
- EM : -3,82%; IC 95%: -7,44, -0,21; per CD4
- : -6,96%; IC 95%: -11,96, - 1,97) e sottoinsiemi Th1 (-4,26%; IC 95%: -7,11, -1,40) e aumenti proporzionali nei sottoinsiemi naïve (per CD4
- : 10,11%; IC 95%: 3,30, 16,92%). Non sono state osservate variazioni per la CR giornaliera o per le diete a peso stabile. Cambiamenti più grandi all'interno della persona nei metaboliti lisofosfolipidi e lisoplasmalogeni nella CR intermittente sono stati associati a maggiori riduzioni nei sottogruppi di cellule T di memoria e maggiori aumenti nei sottogruppi di cellule T naïve.
Interpretazione
Nelle persone con SM, una dieta CR intermittente era associata alla riduzione dei sottogruppi di cellule T di memoria e di alcuni marcatori lipidici biologicamente rilevanti.
Finanziamento
National MS Society, NIH, Johns Hopkins Catalyst Award.
Ricerca nel contestoProve prima di questo studio
Abbiamo cercato in PubMed il termine [("digiuno intermittente") o ("digiuno") o ("dieta") o ("studio sull'alimentazione")) AND ("biomarcatore") o ("immunologia") o ("metabolomica " o "metaboliti") o ("adipokine" o "leptina" o "adiponectina")] AND ("sclerosi multipla"), pubblicati prima del 9 marzo 2022. I risultati includevano il nostro studio precedente che dimostrava che le diete a restrizione calorica o a digiuno sono modi sicuri ed efficaci per raggiungere la perdita di peso nelle persone con sclerosi multipla (SM).Questo studio non ha esplorato l'effetto di queste diete sui biomarcatori rilevanti della SM. Nei modelli di SM, il digiuno intermittente o la restrizione calorica hanno fornito ulteriori effetti antinfiammatori e neuroprotettivi La maggior parte degli altri studi sulle diete nelle persone con SM che includevano i risultati dei biomarcatori includevano diversi tipi di diete o includevano sottogruppi di pazienti molto specifici.Altri studi sull'uomo sulla restrizione calorica intermittente non hanno rigorosamente misurato o monitorato l'apporto calorico nel corso dello studio.
Valore aggiunto di questo studio
Espandiamo il nostro lavoro precedente per dimostrare che la randomizzazione a una dieta a restrizione calorica intermittente è associata a cambiamenti nei livelli circolanti di diversi metaboliti lipidici rilevanti che includono acil carnitine e sottoinsiemi di glicerofosfolipidi. Mostriamo anche che la restrizione calorica intermittente è associata a una riduzione dei sottoinsiemi di cellule T di memoria; questa riduzione è stata più evidente negli individui randomizzati a una restrizione calorica intermittente piuttosto che a una dieta dimagrante tradizionale.
Implicazioni di tutte le prove disponibili
Le diete a restrizione calorica intermittente sono modi sicuri ed efficaci per ottenere la perdita di peso nelle persone con SM. Possono essere associati a una maggiore riduzione dei sottogruppi di cellule T di memoria rispetto alle diete dimagranti tradizionali. Sono necessarie ricerche future su popolazioni più ampie per accertare le implicazioni a lungo termine del seguire una dieta a digiuno intermittente.
introduzione
La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune e neurodegenerativa del sistema nervoso centrale (SNC).
1 La progressione della disabilità è attualmente irreversibile e la prognosi è molto variabile, evidenziando la necessità di continuare la ricerca sul rischio modificabile e sui fattori protettivi per il peggioramento della malattia. Il ruolo della dieta è emerso come un fattore importante che può modulare il decorso della SM.
2 , 3 , 4 , 5 La dieta potrebbe potenzialmente farlo attraverso la modulazione diretta del sistema immunitario, tramite alterazioni dei batteri intestinali o tramite modifiche al metabolismo (p. es., modifica dello stress ossidativo o della funzione mitocondriale).
Un aspetto della dieta che si rivela promettente come obiettivo interventistico riguarda i tempi e la quantità di apporto calorico. La restrizione calorica intermittente (CR) o il digiuno prima dell'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello murino di SM, porta a un decorso meno aggressivo.
6 , 7 , 8 La CR intermittente riduce anche le citochine pro-infiammatorie e altri marcatori infiammatori nei topi EAE e studi emergenti suggeriscono che la CR intermittente promuove la rigenerazione degli oligodendrociti in altri modelli murini di SM.
6 , 7 , 8 Negli esseri umani sani, obesi o con asma, la CR intermittente è associata a riduzioni simili dei marcatori infiammatori e può avere effetti metabolici più forti rispetto alla diffusione dello stesso deficit calorico nel corso di una settimana.
9 , 10 , 11 Abbiamo confrontato diversi tipi di diete CR con una dieta stabile in base al peso in uno studio sull'alimentazione controllata di persone con SM intitolato "Alternanza dei tempi e della quantità di calorie nella SM" o ATAC-MS. Le diete CR includevano una CR intermittente o una dieta "a digiuno" con una CR giornaliera più tradizionale in cui i deficit calorici sono distribuiti uniformemente in un periodo di 7 giorni. Abbiamo scoperto che entrambi i tipi di diete CR non sono solo sicuri e fattibili, ma sono anche associati alla perdita di peso e al miglioramento della salute emotiva.
3 Qui, estendiamo questi risultati iniziali valutando come diversi tipi di diete CR influenzino più mediatori biologici prossimali con rilevanza specifica per la SM, compresi i cambiamenti nelle adipochine (p. es., leptina, adiponectina),
12 , 13 , 14 sottoinsiemi di cellule immunitarie,
15 , 16 , 17 e il metaboloma plasmatico.
18 ,19 Esploriamo anche se i cambiamenti all'interno della persona nei livelli di metaboliti mediano potenzialmente i cambiamenti nei tratti metabolici o nei sottoinsiemi di cellule immunitarie. Presi insieme, questi risultati possono fornire un ulteriore prezioso passo avanti nella comprensione degli effetti di diversi tipi di CR su importanti esiti intermedi di SM.
Metodi
Popolazione di studio
Come descritto in precedenza, lo studio ATAC-MS ha reclutato persone con SM di età compresa tra 18 e 50 anni dal Johns Hopkins MS Center a partire da dicembre 2015 (clinicaltrials.gov:
NCT02647502 ).
3 I partecipanti eleggibili hanno soddisfatto i criteri del 2010 per la SM recidivante-remittente, hanno avuto una nuova lesione o una ricaduta negli ultimi 2 anni, hanno avuto una durata della malattia ≤15 anni, scala EDSS (Expanded Disability Status Scale) <6,0, erano stabili su un iniettabile di prima linea Terapia per la SM (interferone beta o glatiramer acetato) o non in terapia per i 6 mesi precedenti la visita di base e non prevedeva di modificare la vitamina D o i farmaci per la tiroide per le successive 48 settimane. Nessun partecipante ha cambiato la terapia per la SM o ha avuto una ricaduta nel periodo di 8 settimane. I partecipanti dovevano anche avere un BMI di almeno 23 (per garantire che i partecipanti mantenessero un peso sano durante lo studio), mantenere un peso stabile (± 8 libbre) per i 3 mesi precedenti lo studio e non seguire attualmente una dieta specializzata per la SM o essere forti fumatori (definito come fumo autodichiarato di <1 sigaretta al giorno). I criteri di esclusione erano una storia di diabete, disturbi alimentari, malattie renali, uso di warfarin, interventi chirurgici importanti nei 3 mesi precedenti, chemioterapia nell'ultimo anno e gravidanza o allattamento, tutti elementi che è possibile che il digiuno possa avere un impatto sfavorevole.
Progettazione dello studio
Una panoramica del disegno dello studio è fornita nella
Figura 1 A. Per determinare con precisione il fabbisogno energetico, tutti i partecipanti sono stati sottoposti a calorimetria indiretta. Altezza e peso (usati per calcolare l'indice di massa corporea [BMI] come kg/m
2) sono stati registrati. I partecipanti sono stati randomizzati a 1 di 3 diete: 1) una dieta di controllo, in cui il partecipante ha ricevuto il 100% del proprio fabbisogno calorico 7 giorni alla settimana, 2) una dieta CR giornaliera, in cui il partecipante ha ricevuto il 78% del proprio fabbisogno calorico il suo fabbisogno calorico 7 giorni a settimana, o 3) una dieta CR intermittente, in cui il partecipante ha ricevuto il 100% del proprio fabbisogno calorico in 5 giorni a settimana e il 25% del proprio fabbisogno calorico 2 giorni a settimana (cioè, una dieta in stile “5:2”). I deficit calorici settimanali compositi erano simili tra le due diete CR. I partecipanti hanno anche fornito campioni di sangue pre-prandiale la prima mattina al basale e durante le settimane 4 e 8. Il plasma è stato isolato utilizzando un protocollo standardizzato e conservato a -80°C e anche le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate seguendo un protocollo standardizzato e conservati in azoto liquido. Le visite durante le settimane 4 e 8 si sono svolte dopo un giorno di assunzione del 25% per gli individui nel braccio CR intermittente. La randomizzazione è stata stratificata per stato di obesità (BMI <30 kg/m2
2 o BMI≥30 kg/m
2 ) ed è stato eseguito dallo statistico dello studio dopo la visita di riferimento/di arruolamento.
Figura 1
(a) Panoramica del disegno dello studio ATAC-MS.
(b) Diagramma consorte per i partecipanti ATAC-MS. I partecipanti che non hanno completato lo studio non hanno fornito ragioni specifiche per il ritiro.
Intervento
Ciascuna delle diete in studio è stata standardizzata per l'assunzione mediana degli Stati Uniti di carboidrati, proteine e grassi (per evitare il co-intervento dovuto a drastici cambiamenti dei componenti dietetici). Anche il contenuto relativo di macronutrienti in un periodo di 1 settimana era paragonabile tra le diete in studio. In un periodo di 8 settimane, tutti i pasti sono stati preparati dal laboratorio di ricerca sulla nutrizione umana di Beltsville (Beltsville, MD) del Dipartimento dell'agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e spediti a casa dei partecipanti due volte a settimana. Tutti i pasti sono stati adattati alle esigenze caloriche specifiche del singolo partecipante (come determinato dalla calorimetria indiretta e dallo stato di randomizzazione). Abbiamo valutato l'aderenza tramite richiami dietetici di persona 24 ore su 24 condotti dai dietologi dello studio due volte durante le settimane 4 e 8.
Risultati
Gli esiti primari dello studio erano la sicurezza e la fattibilità di diversi tipi di diete CR nelle persone con SM; i risultati per l'outcome primario erano stati precedentemente riportati. Per questo studio abbiamo considerato le seguenti serie di risultati intermedi: 1) adipochine, 2) sottoinsiemi di cellule immunitarie e 3) metabolomica non mirata.
Adipochine
La leptina plasmatica e l'adiponectina sono state misurate utilizzando kit ELISA disponibili in commercio e sono state condotte in un unico lotto (Mesoscale Discovery, Rockville, Maryland; per la leptina: numero di catalogo K151BYC, per l'adiponectina: numero di catalogo: K151BXC)
Sottoinsiemi di cellule immunitarie
I PBMC dal basale e dalla settimana 8 sono stati isolati da sangue intero raccolto in vacutainer con eparina sodica per prevenire la coagulazione. I leucociti sono stati separati mediante separazione di Ficoll e crioconservati in RPMI con il 10% di siero umano e il 10% di DMSO, quindi conservati a lungo termine in azoto liquido. Dopo il completamento di tutte le visite di studio, le cellule sono state scongelate e lavate in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con siero bovino fetale (FBS) al 10% e 100 U/mL di DNAsi-I. Le cellule sono state quindi colorate con colorante Zombie NIR per consentire l'identificazione di cellule morte (permeabili), quindi incubate con una soluzione di blocco del recettore Fc per bloccare il legame anticorpale non specifico. La colorazione dell'anticorpo coniugato è stata eseguita in tampone FACS (2% FBS in PBS con EDTA 2mM) a temperatura ambiente per 30 minuti seguito da 2 lavaggi in tampone FACS. Sono stati utilizzati anticorpi per i seguenti antigeni: CD3, CD4, CD45RO, CCR7, CCR4, CCR6 e CXCR3. Le cellule colorate sono state acquisite su un citometro a flusso MACS Quant (Miltenyi, Biotec), come descritto in precedenza.
20 ,21 Una panoramica della strategia di gating è fornita nella Figura 1a supplementare. I dettagli sugli anticorpi (compresi gli RRID) sono forniti nella Tabella supplementare 1. Le cellule CD4
+ e CD4
- T (CD4
- come proxy per CD8
+ ) sono state quantificate come percentuale di CD3, che rifletteva la percentuale di cellule vitali. All'interno di questi abbiamo identificato sottoinsiemi di memoria tra cui la memoria effettore (T
EM : CCR7
- CD45RO
+ ), la memoria centrale (T
CM : CCR7
+ CD45RO
+ ) e le cellule naïve (T
naive : CCR7
+ CD45RO
- ). Come definito da CCR4, CCR6 e CXCR3, abbiamo anche quantificato (come %CD4
+ ): Th2 (CCR4
+ , CCR6
− , CXCR3
− ), Th1 (CCR4
− , CCR6
− , CXCR3
+ ), Th17 (CCR4
− , CCR6
+ , CXCR3
− ) e Th1/17 (CCR4
− , CCR6
+ , CXCR3
+ ). La Figura 1b supplementare include anche i controlli di colorazione della fluorescenza meno uno (FMO).
Metabolomica
I campioni di sangue forniti al basale e alle settimane 4, 8 sono stati utilizzati per ottenere il plasma. Per gli individui randomizzati a CR intermittente, i campioni alle settimane 4 e 8 sono stati raccolti dopo un giorno di fabbisogno calorico del 25% (cioè dopo un giorno di digiuno). La metabolomica non mirata è stata eseguita in un unico lotto a Metabolon (Durham, NC) e i metodi sono stati descritti in dettaglio altrove.
18 ,19 In breve, i campioni sono stati scongelati e sottoposti a un'ulteriore preparazione (derivatizzazione). I campioni derivatizzati sono stati sottoposti a gascromatografia seguita da spettrometria di massa (GC/MS) o cromatografia liquida seguita da spettrometria di massa tandem (LC/MS/MS). Gli spettri di massa ottenuti da queste tecniche sono stati quindi abbinati a una libreria di spettri derivati da standard per identificare metaboliti specifici e l'area sotto la curva per gli spettri di massa è stata utilizzata per calcolare l'abbondanza relativa di ciascun metabolita. Inizialmente abbiamo incluso 795 metaboliti. Abbiamo quindi implementato la seguente procedura di controllo di qualità (QC) per identificare e rimuovere potenziali metaboliti periferici. Innanzitutto, abbiamo rimosso i metaboliti con > 20% di valori mancanti tra i campioni (n = 125) e valori di metaboliti mancanti imputati utilizzando k-vicini più vicini (10 vicini utilizzati per ciascuna imputazione) per i restanti 670 metaboliti; risultati coerenti sono stati osservati utilizzando il valore minimo dei metaboliti osservati. Abbiamo quindi log-trasformato e ridimensionato tutti i metaboliti. I nostri risultati precedenti dimostrano un'eccellente riproducibilità per la metabolomica in quanto abbiamo dimostrato che i coefficienti di correlazione intraclasse (ICC) sono elevati (gli ICC mediani tra i metaboliti per i campioni replicati erano 0,94; IC 95%: 0,86, 0,98 e 1,2% dei metaboliti aveva ICC <0,40) .
18 Statistiche
Abbiamo valutato le differenze nel cambiamento complessivo in ciascuno degli esiti intermedi (sottotipo di cellula immunitaria, tratto metabolico o metabolita) associati alla randomizzazione alle diete CR, secondo il principio dell'intenzione di trattare (ITT) e utilizzando modelli di regressione a effetti misti. Abbiamo anche considerato modelli che confrontano la randomizzazione con qualsiasi dieta CR (giornaliera o intermittente) con diete di controllo. I modelli sono stati inoltre adeguati per età, sesso, terapia che modifica la malattia della SM e aderenza alle diete in studio. Adattiamo un modello separato per ogni tipo di cellula immunitaria o tratto metabolico. Per le analisi metabolomica, poiché la nostra dimensione del campione era relativamente piccola, abbiamo eseguito analisi concentrandoci sulle differenze nelle vie metaboliche complessive (per ridurre il numero di test statistici) come analisi primarie per questo risultato. Per fare ciò, abbiamo classificato i metaboliti in gruppi (> 3 metaboliti) in base alla relativa funzione biologica (p. es., metabolismo della carnitina, metabolismo del triptofano, tra gli altri); le appartenenze al percorso per ciascun metabolita sono incluse come parte della tabella supplementare 3. Abbiamo quindi condotto un'analisi di arricchimento del set di metaboliti (MSEA). Come il suo predecessore Gene Set Arrichment Analysis (GSEA), MSEA è un metodo computazionale che valuta se insiemi di metaboliti (o geni, nel caso di GSEA) mostrano differenze concordanti in un confronto di diversi stati biologici.
22 ,23 Per ciascuna via metabolica, viene calcolato un punteggio di arricchimento normalizzato (NES) utilizzando metodi simili a GSEA in quanto ogni via NES è normalizzata dalla dimensione della via e incorpora test statistici individuali per ciascuno dei metaboliti considerati. Qui, abbiamo considerato il tasso di cambiamento per ciascun metabolita stimato dai modelli a effetti misti diviso per il suo errore standard come i test forniti a MSEA. Il significato statistico per ciascun percorso viene quindi assegnato utilizzando una procedura di permutazione per generare la distribuzione nulla del NES e il valore P viene calcolato rispetto a questa distribuzione nulla come in GSEA.
22 Nelle analisi di metabolomica secondaria, abbiamo anche considerato i risultati dei cambiamenti nei singoli metaboliti.
Nelle analisi esplorative, abbiamo anche valutato se i cambiamenti nelle adipochine o nei sottotipi di cellule immunitarie fossero mediati da cambiamenti all'interno della persona nei livelli di metaboliti circolanti. Per fare ciò, abbiamo calcolato una media complessiva del metabolita specifico della persona (ad esempio, la media dei livelli del metabolita di una persona in tutte le visite) e una misura intra-persona come differenza tra la media complessiva specifica della persona di un metabolita e il metabolita della persona livello in ogni momento. Abbiamo quindi adattato un modello misto per un dato risultato intermedio (sottoinsieme di adipochine o cellule T) in cui abbiamo incluso un termine per la media complessiva dei metaboliti e un termine per la differenza all'interno della persona, nonché un insieme simile di covariate come nelle nostre analisi primarie ( cioè, età, sesso, MS DMT e aderenza). Quindi, in modo simile alle analisi globali basate sulla metabolomica, abbiamo eseguito l'MSEA sul tasso stimato di cambiamento all'interno della persona per ciascun metabolita diviso per il suo errore standard. Adattiamo anche modelli di cambiamento all'interno della persona per i cambiamenti nelle adipochine in quanto si riferiscono a sottoinsiemi di cellule T; i cambiamenti nelle adipochine sono stati collegati a differenze nella funzione delle cellule T in studi precedenti.
6 ,7 ,24 Abbiamo adattato tutte le analisi per confronti multipli utilizzando il tasso di false discovery (FDR). Abbiamo selezionato l'FDR come metodo per tenere conto della falsa scoperta per accogliere la correlazione sottostante tra marcatori delle cellule T e metaboliti.
Etica
Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso scritto all'iscrizione e lo studio è stato approvato dal Johns Hopkins Institutional Review Board (IRB00065805). A causa della dimensione del campione dello studio e per preservare la riservatezza e l'anonimato dei partecipanti, i dati per questo studio non saranno resi disponibili. Allo stesso modo, i dati metabolomici corrispondenti non saranno resi disponibili per ragioni simili (per preservare la riservatezza dei partecipanti).
Ruolo dei finanziatori
Nessuna fonte di finanziamento ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta dei dati, nell'analisi dei dati, nell'interpretazione dei risultati o nella stesura del rapporto.
Risultati
Caratteristiche dei partecipanti allo studio
Le caratteristiche di base dei 36 partecipanti inclusi sono fornite nella
Tabella 1 ed erano generalmente comparabili tra le tre diete dello studio. I partecipanti avevano in media 37,4 anni (deviazione standard [DS]: 7,4), erano prevalentemente donne (81%) e avevano un indice di massa corporea (BMI) medio di 32,6 kg/
m2 . Nessun partecipante ha avuto una ricaduta o un peggioramento neurologico durante il periodo di 8 settimane. Dei 36 partecipanti arruolati, 31 (86%) hanno completato la porzione di alimentazione di 8 settimane dello studio. Un partecipante si è ritirato dal braccio CR intermittente, un partecipante si è ritirato dal braccio CR giornaliero e tre partecipanti si sono ritirati dal braccio di controllo (
Figura 1b). Come riportato in precedenza, i partecipanti randomizzati alla CR intermittente hanno perso in media 3,0 kg (intervallo interquartile [IQR]: -2,0 kg, -4,1 kg) e i partecipanti randomizzati alla CR giornaliera hanno perso in media 3,6 kg (IQR: -3,0 kg, - 4,1 kg); la perdita di peso non differiva significativamente tra i due tipi di CR.
3 Nessun partecipante ha cambiato la terapia per la SM o ha sperimentato un episodio di attività della malattia durante il periodo di alimentazione controllata.Tabella 1 Caratteristiche demografiche e cliniche dei partecipanti allo studio ATAC-MS.
un a Tutti i partecipanti dovevano avere una SM recidivante-remittente per poter beneficiare di questo studio.
b Calcolato come differenza tra le calorie percentuali consumate rispetto a quelle fornite dallo studio alla settimana 8. I valori negativi indicano che i partecipanti hanno consumato meno di quanto fornito dallo studio (p. es., non hanno consumato tutti gli alimenti in studio nei giorni precedenti le visite di studio nelle settimane 4 e 8 quando sono stati eseguiti richiami dietetici).
Nessun cambiamento nei livelli di adipochine con CR
Non abbiamo osservato cambiamenti nella leptina sierica o nell'adiponectina in nessuna delle diete CR nel periodo di 8 settimane. Sia la leptina che l'adiponectina sono diminuite nel braccio di controllo (
Figura 2a ;
Tabella 2 ; differenza della media geometrica nel tempo: leptina: -0,93 µg/mL; IC 95%: da -1,87 a 0,00; P=0,05; adiponectina: -0,54 µg /mL; IC 95%: -0,86, -0,21; P=0,001; [n=36 al basale; valori P derivati dal modello a effetti misti]).
Figura 2
(a) Boxplot raffiguranti i valori di leptina e adiponectina trasformati in log nel corso dello studio per ciascuna delle diete in studio. Il grafico a barre finale illustra il tasso di variazione delle adipochine nel corso dello studio per ciascuna delle diete in studio (n=36 al basale; valori P derivati dal modello a effetti misti).
( b ) Grafici rappresentativi di citometria a flusso per sottoinsiemi di cellule T selezionati per la settimana 0 e la settimana 8 per individui randomizzati a CR intermittenti.
(c)Tasso di variazione dei sottogruppi di cellule T nel periodo di 8 settimane nelle tre diete (n=36 al basale). I tassi sono stati ulteriormente aggiustati per età, sesso, terapia modificante la malattia e aderenza alle diete fornite (calcolata come la differenza delle calorie consumate rispetto alle calorie fornite dallo studio) e sono state derivate da un modello a effetti misti. Per tutti i grafici a barre, * indica P <0,05 aggiustato per FDR. Le cellule CD3
+ ;CD4
− servono come proxy per le cellule CD8
Tabella 2 Modifica dei tratti metabolici e dei sottoinsiemi di cellule immunitarie.
a Indica il tasso di cambiamento in 8 settimane nel tratto metabolico o nel sottogruppo di cellule T. Le differenze sono inoltre aggiustate per età, sesso, terapia che modifica la malattia della SM e aderenza alle diete in studio. I tassi di cambiamento in grassetto per le analisi delle cellule immunitarie erano quelli con valori P aggiustati per FDR <0,05.
b Le cellule CD3
+ ;CD4
− (CD4
− ) fungono da proxy per le cellule CD8.
La CR intermittente altera i sottoinsiemi di cellule T
Nel tempo, gli individui randomizzati a CR intermittenti hanno avuto riduzioni significative nei sottoinsiemi di cellule T di memoria, inclusi i sottoinsiemi di memoria dell'effettore (
Figura 2 b e c;
Tabella 2 ; per CD4
+ EM : -4,87%; IC 95%: -8,59%, -1,15% ; P=0,01 aggiustato per FDR; per CD4
- EM : -6,96%; IC 95%: -11,96, -1,97; P=0,03 aggiustato per FDR) con aumenti concomitanti nei sottogruppi naïve (CD4
- Naïve: 10,11%; IC 95%: 3,30, 16,92%; P=0,02 corretto per FDR; [n=36 al basale; tutti i valori P derivati dal modello a effetti misti]). Gli individui randomizzati alla restrizione calorica intermittente hanno anche sperimentato riduzioni significative delle cellule Th1 (-4,26%; IC 95%: -7,11%, -1,40%; P=0,02 FDR-aggiustato [n=36 al basale; tutti i valori P derivati da effetti misti modello]) durante il follow-up di 8 settimane. Non sono stati osservati cambiamenti degni di nota nei sottogruppi di cellule T per gli individui randomizzati a CR giornaliera o diete stabili di peso. I risultati sono stati simili quando abbiamo ulteriormente aggiustato per lo stato di obesità (BMI ≥30;
Tabella supplementare 2 ).
CR altera il metaboloma circolante
Nelle analisi metabolomica, abbiamo notato cambiamenti in diverse classi di metaboliti lipidici. Ad esempio, nelle analisi basate sul percorso che utilizzano MSEA, abbiamo notato aumenti generali dei metaboliti dell'acil carnitina (che trasportano gli acidi grassi nei mitocondri) per entrambe le diete CR. I NES erano > 2 volte più alti per ciascuna dieta (per qualsiasi CR: NES=2,61, P aggiustato per FDR=8,37E-09; per CR intermittente: NES=2,73, P aggiustato per FDR=3,20E-06; per CR giornaliero : NES=2,49, P aggiustato FDR=1,25E-06;
Figura 3; [n=36 al basale; tutti i valori p derivati da MSEA]). Abbiamo anche notato riduzioni generali dei glicerofosfolipidi negli individui randomizzati a CR, con notevoli cambiamenti nelle fosfatidilcoline (principali costituenti delle membrane plasmatiche), plasmalogeni (antiossidanti endogeni) e lisoplasmalogeni (prodotti del metabolismo del plasmalogeno). Queste differenze erano particolarmente notevoli negli individui randomizzati a CR intermittente, in cui sono stati osservati cambiamenti significativi principalmente per i plasmalogeni della fosfatidiletanolamina (PE) piuttosto che per i plasmalogeni della fosfatidilcolina (PC) (
Figura 3c). Le diete CR erano anche associate ad aumenti del metabolismo di glicina, treonina e serina (NES: 1,91; P aggiustato per FDR=0,05; [n=36 al basale; tutti i valori P derivavano MSEA]). Nelle analisi di sensibilità, abbiamo osservato risultati relativamente coerenti quando abbiamo applicato la nostra analisi del percorso basata sui ranghi. I risultati per tutti i metaboliti nel tempo e le vie metaboliche sono riassunti nella tabella supplementare 3. I risultati per i singoli metaboliti organizzati per vie sono forniti anche come parte del browser di accompagnamento disponibile all'indirizzo
https://brbdai-kathryn-fitzgerald.shinyapps.io/Calorie -restrizione-biomarcatore/ .
Figura 3
(a) Grafico del vulcano che illustra i risultati delle analisi dei singoli metaboliti (n = 36 al basale). I metaboliti etichettati in rosso denotano metaboliti che sono cambiati in modo significativo (valore P aggiustato per FDR <0,05) e sono stati derivati da un modello a effetti misti. I tassi sono stati inoltre adeguati per età, sesso, terapia modificante la malattia e aderenza alle diete fornite (calcolate come la differenza delle calorie consumate rispetto alle calorie fornite dallo studio.
(b)Punteggi di espressione normalizzati (NES) dalle analisi di arricchimento del set di metaboliti (MSEA) derivati per i cambiamenti dei metaboliti nel tempo per qualsiasi CR, CR intermittente e giornaliero. L'ultimo pannello denota le differenze di NES tra i percorsi tra la CR intermittente e quella giornaliera. ** indica percorsi che erano significativi dopo aver tenuto conto della falsa scoperta (valore P aggiustato per FDR <0,05; n=36 al basale).
(c) Risultati individuali per i metaboliti in percorsi selezionati identificati nell'MSEA. Le barre sono colorate in base alla direzione e al livello di significatività nelle singole analisi.
Il tasso di cambiamento per ciascun metabolita per gli individui randomizzati a CR intermittente era correlato positivamente con il tasso di cambiamento per ciascun metabolita per gli individui randomizzati a CR giornaliero (p. es., questo suggerisce che i metaboliti generalmente cambiano in modo simile per gli individui randomizzati a CR intermittente e CR nel corso dello studio). Ad esempio, la correlazione di Spearman tra il percorso NES per CR intermittente rispetto a NES per CR giornaliero era 0,86 (IC 95%: 0,76, 0,92; P<1E-16;
Figura 3 b; [n=59 percorsi; valori P calcolati tramite il metodo asintotico t) e la correlazione di Spearman tra i tassi di variazione tra i singoli metaboliti per gli individui randomizzati a CR intermittente e gli individui randomizzati a CR giornaliera era 0,30 (IC 95%: 0,22, 0,39).
Analisi esplorativa del cambiamento all'interno della persona nei metaboliti dovuto alla CR come predittore del cambiamento nei sottogruppi di cellule immunitarie
Nelle analisi esplorative, abbiamo anche valutato se i cambiamenti nelle adipochine o nei sottotipi di cellule immunitarie fossero correlati ai cambiamenti all'interno della persona che si verificano nel metaboloma plasmatico. Abbiamo concentrato queste analisi su individui randomizzati al CR intermittente poiché questi individui, in media, hanno mostrato cambiamenti significativi nei sottogruppi di cellule immunitarie (rispetto a quelli randomizzati a diete giornaliere o di controllo). È interessante notare che negli individui randomizzati a CR intermittenti, abbiamo notato cambiamenti nei prodotti del metabolismo dei glicerofosfolipidi che possono mediare alcuni dei cambiamenti osservati nei sottogruppi di cellule immunitarie (Figura supplementare 2a, 2b e 2c, Tabella supplementare 4 e il nostro browser:
https://brbdai: -kathryn-fitzgerald.shinyapps.io/Calorie-restriction-biomarker/). Ad esempio, le riduzioni intra-persona dei lisofosfolipidi erano generalmente associate a riduzioni concomitanti nella memoria centrale (Figura supplementare 2a; per CD4
+ CM : NES: -1,93; P=0,005 aggiustato per FDR; per CD4
- CM : NES: -2,16 ; P=0.001 aggiustato per FDR), Th1 (NES: -1.87; P=0.003 aggiustato per FDR) e Th1/17 (NES: -2.26; P=8.89E-5 aggiustato per FDR; sottoinsiemi e aumento del CD4+
Naïve - sottoinsieme (NES: 2,07; P aggiustato per FDR = 0,006; [n=12 tutti i valori P derivati da MSEA]).Le riduzioni intra-persona dei lisofosfolipidi erano anche associate ad aumenti di CD4
+ Naïve-sottoinsiemi (NES: 2,07; FDR-adjusted P=0,006; [n=12 tutti i valori P derivati da MSEA]). La variazione intra-persona dei lisolipidi è stata anche associata ad aumenti dell'adiponectina (NES: 2,39; P aggiustato per FDR = 1,01E-4) e diminuzioni della leptina (NES: 3,14; P aggiustato per FDR = 6,86E-7; [n= 12 tutti i valori P derivati da livelli di MSEA]). In particolare, cambiamenti simili all'interno della persona nei lisofosfolipidi o nei lisoplasmalogeni non erano associati a cambiamenti nei sottogruppi di cellule T per gli individui randomizzati a CR giornaliero (Figura 3 supplementare). Il cambiamento intra-persona dei livelli di leptina o adiponectina non era associato a cambiamenti nei sottogruppi di cellule T (tutti i valori P aggiustati per FDR>0,05; Tabella 5 supplementare).
Discussione
Questo studio randomizzato sull'alimentazione controllata ha valutato gli effetti delle diete CR intermittenti o giornaliere nelle persone con SM su diverse classi rilevanti di potenziali mediatori biologici che includevano adipochine, vari sottogruppi di cellule T e il metaboloma circolante. La leptina e l'adiponectina non sono cambiate in modo significativo negli individui randomizzati a una dieta CR, mentre la randomizzazione a una dieta CR intermittente è stata associata ad alterazioni nei sottogruppi di cellule T e in diverse classi di metaboliti lipidici biologicamente rilevanti.
Un riepilogo degli effetti del digiuno su diverse popolazioni di cellule T è fornito nella Figura 4 supplementare. La nostra valutazione dei cambiamenti nei sottoinsiemi di cellule T associati al digiuno intermittente, inclusi notevoli aumenti proporzionali delle cellule naïve e diminuzioni delle cellule di memoria. I cambiamenti osservati nei linfociti T naïve sono coerenti con gli studi EAE sulla CR intermittente, in cui il numero relativo di linfociti T naïve aumenta con il digiuno oltre allo spostamento dei linfociti T regolatori (Treg) lontano dai linfociti T effettori (compresa una riduzione del cellule Th1, come nel nostro studio).
8 Nelle persone, uno studio precedente ha randomizzato 17 persone con SM che si stavano riprendendo da una ricaduta a digiuni a giorni alterni o diete abituali per un periodo di 15 giorni.
6 La CR intermittente è stata associata a diminuzioni delle cellule T CD4
+ e CD8
+ naïve (contrariamente al nostro studio) e con un aumento della funzione di soppressione delle Treg (sebbene il numero di Treg fosse invariato). Tuttavia, è importante notare che tutti i partecipanti a quello studio sono stati trattati con glucocorticoidi, che potrebbero aver influenzato la composizione dei linfociti. Inoltre, anche la durata più breve dello studio sul recupero delle ricadute (15 giorni) potrebbe aver giocato un ruolo nei risultati disparati rispetto al nostro studio.
Non abbiamo riscontrato alcun cambiamento nella leptina o nell'adiponectina che si verifica come risultato della randomizzazione a CR intermittente, nonostante diversi studi precedenti implicassero un legame tra il digiuno e l'abbassamento dei livelli di leptina e l'aumento dell'adiponectina.
9 ,25 , 26 , 27 Questa scoperta potrebbe essere correlata alla nostra dimensione del campione relativamente limitata e alla variabilità intrinseca dei livelli circolanti (p. es., grande variabilità nei livelli per i partecipanti al braccio di controllo per i quali non sono state osservate variazioni significative di peso. È anche possibile che protocolli di digiuno diversi (giorno alternativo digiuno, alimentazione a tempo limitato) oltre la dieta 5:2 valutata qui può avere effetti differenziali sulle adipochine o su altri parametri delle cellule immunitarie.
28 Precedenti studi meccanicistici hanno anche dimostrato un legame tra leptina e attivazione dei linfociti T e polarizzazione pro-infiammatoria, suggerendo che la leptina può mediare gli effetti del digiuno sulla distribuzione e funzione relativa dei linfociti T. I nostri risultati suggeriscono effetti potenzialmente non dipendenti dalla leptina della CR intermittente sulle modifiche ai sottoinsiemi di cellule T. Poiché i cambiamenti nella disponibilità di alcuni metaboliti lipidici possono spostare la distribuzione dei linfociti T lontano dai linfociti T effettori, è possibile che alcuni dei cambiamenti osservati nei metaboliti lipidici possano mediare alcune delle associazioni notate tra CR intermittente e i cambiamenti nella composizione relativa di cellule T. Una spiegazione alternativa è che i livelli ridotti di glicerofosfolidi e lisoplasmalogeni,
29 ,30 Poiché queste popolazioni di cellule T possono quindi produrre altri mediatori pro-infiammatori che possono influire sulla funzione complessiva delle cellule T, ciò offre una potenziale spiegazione per i cambiamenti immunologici osservati nel nostro studio.
Mentre i trigliceridi costituiscono la fonte primaria di lipidi immagazzinati nell'uomo, i fosfolipidi sono componenti critici delle membrane plasmatiche e degli eicosanoidi (p. es., prostaglandine o leucotrieni). I nostri risultati evidenziano riduzioni in molte classi di glicerofosfolipidi, inclusi i metaboliti della fosfatidilcolina, tra gli individui randomizzati a una dieta CR. Abbiamo anche notato una riduzione dei livelli di plasmalogeni circolanti; i plasmalogeni sono un sottotipo di glicerofosfolipidi che possono funzionare come antiossidanti endogeni e proteggere i lipidi di membrana o le lipoproteine da specie reattive dell'ossigeno aberranti.
31 Tuttavia, studi emergenti riportano anche altre potenziali funzioni, incluso il coinvolgimento nelle vie di segnalazione o nella differenziazione cellulare, che potrebbero potenzialmente spiegare i nostri risultati.
31 ,32 In particolare, abbiamo osservato una riduzione delle fosfatidilcoline plasmalogeniche piuttosto che delle fosfatidilcoline plasmalogeniche, potenzialmente correlata ad alterazioni degli enzimi necessari per la loro formazione nel perossisoma.
Molti dei nostri risultati metabolomici sono coerenti con studi precedenti su CR acuta (oltre 1 giorno), digiuno prolungato (oltre 10 giorni) e dopo terapia sostitutiva con leptina (una nota anoressica) in individui con carenza congenita di leptina.
33 , 34 , 35 Ad esempio, uno studio ha confrontato i profili metabolomici in una coorte di individui nel corso di quattro giorni: al basale, dopo due giorni in cui i partecipanti hanno ridotto l'apporto calorico del 90% e un giorno finale in cui i partecipanti hanno mangiato ad libitum. I ricercatori hanno notato aumenti significativi dei metaboliti dell'acil carnitina, nonché cambiamenti simili di glicerofosfolipidi, lisofosfolipidi (prodotti del metabolismo dei glicerofosfolipidi), plasmalogeni e lisoplasmalogeni (prodotti dei metaboliti del plasmalogeno) come abbiamo osservato nel nostro studio.
34 Cambiamenti simili in queste classi lipidiche sono stati osservati anche in uno studio che ha misurato i profili metabolomici nel corso di un digiuno di 10 giorni
33 e dopo la terapia sostitutiva della leptina tra individui con deficit congenito.
35 È interessante notare che entrambi gli studi sulla CR acuta e prolungata rilevano anche riduzioni simili delle fosfatidiletanolamina plasmalogena e non delle fosfatidilcoline associate al digiuno.
I punti di forza del nostro studio includono il suo design randomizzato e la standardizzazione della dieta tra i bracci di randomizzazione; ai partecipanti è stato chiesto di consumare solo gli alimenti forniti dallo studio per un periodo di 8 settimane, riducendo al minimo i potenziali effetti legati alle differenze nella composizione dietetica sottostante. Inoltre, gli studi dietetici in cui viene fornito il cibo possono avere una migliore aderenza complessiva (indipendentemente dal braccio di randomizzazione) rispetto agli studi dietetici solo orientativi.
36 ,37 Abbiamo anche considerato una gamma relativamente ampia di potenziali intermedi biologici che vanno dalle cellule immunitarie a misure altamente sensibili della salute metabolica.
Questo studio ha anche diversi limiti che vale la pena notare. In primo luogo, lo studio è stato di durata relativamente breve; La SM è una malattia che si evolve nel corso di decenni, quindi non è chiaro se quali siano le implicazioni a lungo termine dei nostri risultati. Gli studi che includono i tradizionali risultati clinici e radiografici nelle persone con SM tendono ad avere una durata di almeno 2 anni. Inoltre, abbiamo incluso relativamente pochi individui; tuttavia, il nostro studio è stato progettato in modo univoco su persone con SM e può informare la progettazione del lavoro futuro in quest'area. Le analisi qui presentate includevano esiti secondari per lo studio originale e non erano associate a dimensioni del campione o calcoli di potenza. I partecipanti a questo studio dovevano assumere una terapia di prima linea per la SM o non essere in terapia; i risultati potrebbero non essere generalizzabili alle persone con SM che assumono immunoterapie più forti. Inoltre, la nostra dimensione del campione ci ha anche impedito di valutare la potenziale modifica dell'effetto in base al tipo di terapia immunitaria. Il nostro studio ha incluso anche relativamente pochi uomini e individui non bianchi che potrebbero limitare la generalizzabilità dei risultati. Per le analisi delle cellule immunitarie, abbiamo incluso anche i campioni di base e della settimana 8, quando è possibile che gli effetti del digiuno intermittente possano essere stati osservati prima. Abbiamo anche condotto tutte le analisi utilizzando campioni congelati, che potrebbero aver avuto un impatto sulle analisi dei linfociti T, dei metaboliti o delle adipochine; tuttavia, abbiamo seguito procedure standardizzate in cieco rispetto allo stato di randomizzazione dei partecipanti, quindi ci aspetteremmo che qualsiasi pregiudizio fosse non differenziale (e, quindi, tendente al nullo). Inoltre, le quantificazioni del sottoinsieme di cellule T sono riportate come percentuali anziché conteggi assoluti a causa dell'analisi eseguita su campioni congelati. Sebbene il nostro lavoro precedente non abbia riportato cambiamenti significativi nei livelli lipidici o nel glucosio a digiuno, i cambiamenti in altri biomarcatori cardiovascolari rilevanti, tra cui la proteina C reattiva o il corticosterone, non sono stati esplorati e potrebbero essere rilevanti. Anche il nostro studio sull'alimentazione era remoto e le informazioni sull'aderenza erano auto-riferit
