Elettrochemioterapia mediante trattamento con campo
elettromagnetico pulsato (PEMF) nel melanoma di topo
B16F10 in vivo
Simona Kranjc ,
1 Matej Kranjc ,
2 Janez Scancar ,
3 Jure Jelenc ,
4 Gregor Sersa ,
1 e Damijan Miklavcic 2
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Astratto
introduzione
L'elettroporazione è un metodo fisico che consente la consegna di farmaci impermeabili,
macromolecole, proteine e materiale genetico (DNA plasmidico, siRNA, miRNA) nelle cellule.
1
L' elettroporazione è correlata al voltaggio transmembrana indotto che, se sufficientemente elevato,
consente la formazione di modifiche strutturali temporanee nella membrana plasmatica e ne
aumenta la permeabilità per molecole altrimenti prive di meccanismi di trasporto
transmembrana.
2 – 5 L' elettroporazione delle cellule è prevalentemente indotta da campi elettrici
pulsati, che sono generati con il treno di impulsi elettrici ad onda quadra di ampiezza sufficiente che
stabiliscono un campo elettrico locale (centinaia di V/cm).
1 , 3 , 6 , 7L'intensità del campo elettrico e la
durata degli impulsi determinano se i cambiamenti strutturali nella membrana plasmatica sono
reversibili, consentendo alle cellule di sopravvivere, o irreversibili, portando alla morte cellulare, a
causa della perdita dell'omeostasi.
8 - 11 Oggigiorno, elettroporazione reversibile viene utilizzato
come tecnologia piattaforma 12 e tra l'altro per il drug delivery a vari tessuti, con finalità
terapeutiche per il trattamento del cancro, noto come elettrochemioterapia.
7 , 13 - 18
L'elettrochemioterapia è utilizzata nel trattamento dei tumori cutanei umani di diversa istologia, ed
è stata tradotta anche nel trattamento dei tumori profondi.
15 , 18 - 22 Parallelamente,
l'elettrochemioterapia viene utilizzata per il trattamento dei tumori in oncologia veterinaria.
23 - 26 I
principali chemioterapici utilizzati in elettrochemioterapia sono la bleomicina non permeabile e il
cisplatino scarsamente permeabile (CDDP), per via di somministrazione sistemica o
intratumorale. Gli impulsi elettrici possono essere erogati ai tumori tramite elettrodi a piastra non
invasivi, che abbracciano il tessuto, o elettrodi ad ago invasivi, che vengono inseriti nel tumore.
7 , 27
In passato gli effetti dei campi elettromagnetici pulsati applicati esternamente (PEMF) sulle cellule
sono stati ampiamente studiati. È stato dimostrato che il PEMF applicato esternamente può
influenzare la trasduzione del segnale intracellulare, influenzare le proteine citoscheletriche
coinvolte nella modificazione della forma cellulare, indurre cambiamenti nel potenziale di
membrana mitocondriale e inoltre aumentare il trasporto molecolare transmembrana
(elettroporazione).
28 - 34 Da allora, alcuni studi hanno effettivamente definito i parametri PEMF che
hanno consentito l'elettropermeabilizzazione delle cellule con successo; cioè un gran numero di 25
fino a 800 impulsi di campo magnetico lungo μs applicati a frequenze da 25 Hz fino a 40 Hz e forza
da 725 V/m fino a 160 kV/m. 30 , 35 ,36 Inoltre, il suo utilizzo come strumento di elettroporazione è
stato dimostrato in un approccio per la somministrazione di farmaci e di DNA
plasmidico.
36 , 37 Pertanto, tale induzione elettromagnetica con correnti alternate ha il potenziale per
una semplice elettroporazione tissutale senza contatto, utilizzata per l'elettrochemioterapia e
l'elettrotrasferimento genico.
La maggior parte degli studi con elettroporazione indotta da PEMF utilizzava impulsi
bipolari. Generalmente, un numero di impulsi più corto e più grande ha portato a una migliore
permeabilizzazione della membrana.
30 , 34 In uno studio recente, il campo magnetico variabile nel
tempo di 6,1 T è stato mostrato come uno strumento interessante nella somministrazione di farmaci
per il trattamento antimicotico, nonché per l'elettroporazione irreversibile.
36 , 38 Inoltre, gli impulsi
bipolari generati dal campo magnetico (4 T) sono stati utilizzati per l'elettrotrasferimento genico del
DNA plasmidico nella pelle. 37 Pertanto, come applicazione semplice, non invasiva e senza contatto
di PEMF, che potrebbe consentire l'elettroporazione delle cellule nel tessuto, questo approccio ha
mostrato il potenziale utilizzo per le applicazioni cliniche.
A causa di pochi studi nel campo dell'elettroporazione indotta dal campo elettromagnetico pulsato,
abbiamo progettato esperimenti e considerato l'uso di tale tecnica di consegna fisica nel trattamento
del cancro, come modello per l'elettroporazione dei tessuti in vivoindotto da PEMF. Se fattibile ed
efficace, l'elettroporazione indotta da PEMF avrebbe il vantaggio rispetto all'elettroporazione
"convenzionale", poiché è non invasiva, senza contatto e non induce dolore durante
l'elettroporazione. Abbiamo valutato la fattibilità e l'efficacia antitumorale dell'elettroporazione
indotta con PEMF come sistema di somministrazione di farmaci per CDDP nei tumori sottocutanei
del melanoma murino B16F10. Per dimostrare il meccanismo alla base dell'elettroporazione
abbiamo misurato il platino (Pt) legato al DNA nei tumori. L'elettroporazione indotta da PEMF ha
dimostrato di facilitare l'assorbimento del farmaco nei tumori, come il CDDP, fornendo così prove
della sua fattibilità ed efficacia.
Efficacia antitumorale dell'elettrochemioterapia mediata da PEMF
L'esposizione di tumori a PEMF o EP convenzionale, eseguita 3 minuti dopo l'iniezione endovenosa
di CDDP, ha comportato un significativo ritardo della crescita del tumore, fino a 3 giorni rispetto ai
tumori non trattati, nonché rispetto alle monoterapie. tuttavia
Un effetto antitumorale significativamente maggiore è stato ottenuto dopo l'elettrochemioterapia
convenzionale rispetto all'elettrochemioterapia mediata da PEMF. Il trattamento dei tumori con la
sola CDDP o l'esposizione a PEMF o EP convenzionale non ha avuto effetti significativi sulla
crescita del tumore
(Tabella 1, Figura 3).
Efficacia antitumorale dell'elettrochemioterapia con CDDP mediata da PEMF nel melanoma murino
B16F10. I dati sono stati raccolti da due esperimenti individuali e ogni punto sul grafico rappresenta la media
e l'errore standard della media (AM ± SE). Ogni gruppo era composto da almeno 8 animali.
CDDP = iniezione endovenosa di cisplatino (4 mg/kg); ECT = elettrochemioterapia, EP dopo iniezione
endovenosa di CDDP; EP = trattamento ad impulsi elettrici; PEMF = trattamento del campo
elettromagnetico pulsato; PEMF + CDDP = PEMF dopo iniezione endovenosa di CDDP.
L'applicazione di PEMF non ha esercitato contrazione muscolare, indicando una procedura di
trattamento indolore. Inoltre, tutti i trattamenti sono stati ben tollerati dagli animali, poiché non è
stata ottenuta alcuna perdita di peso corporeo o cambiamenti rilevabili nella pelle, esposti al
trattamento con PEMF durante il periodo di osservazione, indicando che non vi era tossicità
sistemica dopo i trattamenti.
Complessivamente, l'effetto antitumorale CDDP, ovvero il farmaco chemioterapico utilizzato,
nell'elettrochemioterapia eseguita da PEMF è risultato significativamente aumentato rispetto alle
monoterapie, presumibilmente a causa del trasporto facilitato di CDDP. Tuttavia,
l'elettrochemioterapia dopo EP convenzionale era più efficace dell'elettroporazione mediata da
PEMF.
Discussione
Questo studio ha dimostrato l'uso del trattamento del campo elettromagnetico pulsato senza contatto
(PEMF) come approccio per ottenere l'elettroporazione del tessuto tumorale del melanoma, che
aumenta l'assorbimento del farmaco in vivo. Abbiamo valutato per la prima volta l'efficacia
antitumorale dell'elettrochemioterapia ottenuta con PEMF dopo l'iniezione sistemica del farmaco
chemioterapico, CDDP, che viene utilizzato nel protocollo di elettroporazione
convenzionale. Inoltre, abbiamo dimostrato che l'effetto antitumorale era correlato all'aumento
dell'assorbimento del farmaco nelle cellule tumorali elettroporate, dimostrato da una maggiore
quantità di Pt legato al DNA. Pertanto il trattamento PEMF può essere utilizzato (una volta
ottimizzato) per la somministrazione di farmaci non invasivi in vivo,che può essere importante per
ricerche dove è necessario evitare tessuti e organi delicati e per applicazioni cliniche, poiché non è
invasivo, senza contatto e indolore rispetto alla classica elettroporazione con elettrodi diversi.
Il potenziale uso di forti campi magnetici variabili nel tempo che inducevano un campo elettrico ad
aumentare il trasporto molecolare transmembrana ( cioè l' elettroporazione), era già stato suggerito
in precedenza. 30 , 34 - 36 , 38 Al fine di espandere l'uso dell'elettroporazione indotta da PEMF senza
contatto come metodo di somministrazione del farmaco, è stato scelto il modello tumorale
B16F10 in vivo , in quanto rappresenta una grande sfida nel trattamento del melanoma
umano. 1 , 14 , 40 - 43Abbiamo dimostrato che il campo magnetico generato dalla bobina rotonda che ha
indotto i 480 impulsi bipolari, alla frequenza di 80 Hz, durata dell'impulso di 340 μs, ha migliorato
significativamente l'efficacia antitumorale dell'elettrochemioterapia con CDDP. I nostri risultati
sono in accordo con lo studio in vitro , in cui PEMF molto più forte (6,1 T) è stato indicato come
metodo di somministrazione per molecole terapeutiche nei funghi patogeni umani. Vale a dire, è
stato osservato l'effetto sinergico del trattamento simultaneo di 200 impulsi di campo magnetico
applicati alla frequenza di 35 Hz e del farmaco. 36 Tuttavia, l'applicazione di un campo magnetico
più forte (fino a 16,4 T) non ha portato a una migliore permeabilizzazione della membrana. 35La
permeabilizzazione della membrana sembra dipendere maggiormente dalla forma, dal numero e
dalla frequenza degli impulsi generati 34 - 36 oltre che dall'ampiezza del campo elettrico indotto,
simile agli impulsi bipolari generati convenzionalmente. 44 Inoltre, gli impulsi bipolari si sono
dimostrati due volte più efficaci come monopolari e quasi altrettanto efficaci degli impulsi a onda
quadra convenzionali. 37 Infatti, per la quasi uguale permeabilizzazione della membrana deve essere
erogato un numero maggiore di impulsi elettrici bipolari indotti di breve durata a frequenza più
elevata. 37Allo stesso modo, nel nostro studio l'efficacia antitumorale del cisplatino ottenuta
utilizzando un numero breve e maggiore di impulsi elettrici indotti a frequenza più elevata rispetto
agli impulsi elettrici convenzionali era paragonabile. Inoltre, è noto che semplici bobine rotonde
inducono un campo elettrico meno focalizzato e di picco inferiore rispetto alle bobine a forma di
otto. 45 , 46 È stato anche dimostrato in vitro che utilizzando bobine a forma di otto l'aumento del
trasporto molecolare transmembrana potrebbe essere ottenuto da impulsi di frequenza inferiore e
numero maggiore. 34 Tuttavia, noi e altri 34 abbiamo dimostrato che aumentando il numero di
impulsi alla stessa frequenza si può migliorare l'effetto dell'elettroporazione (dati supplementari).
Attualmente, nei protocolli di elettrochemioterapia convenzionali, principalmente impulsi elettrici
ad onda quadra o monotona decrescenti vengono erogati attraverso elettrodi a piastra o ad ago alle
cellule o ai tessuti. 15 , 18 , 23 , 25 Al contrario, solo pochi studi sono stati eseguiti con impulsi elettrici
bipolari per l'elettroporazione di cellule in vitro e tessuti in vivo. 44 , 47 - 55 In generale, le ampiezze
degli impulsi inferiori erano necessarie per un'efficace elettroporazione delle cellule in vitro rispetto
agli impulsi unipolari. 48 , 51Oltre a ciò, anche la forma dell'impulso ha svolto un ruolo importante
nell'elettroporazione delle cellule. 34 , 51 , 56 È stato dimostrato che l'elettroporazione, la morte cellulare
e l'assorbimento di Lucifero Giallo si sono verificati utilizzando gli impulsi bipolari rettangolari al
minimo, gli impulsi bipolari sinusoidali al medio e gli impulsi bipolari triangolari alle ampiezze
degli impulsi più alti. 44 impulsi bipolari sono già stati applicati con successo in elettrochemioterapia
per la clinica umana e veterinaria. 49 , 57 , 58
In effetti, la combinazione dell'elettroporazione indotta da PEMF con CDDP ha avuto una
significativa efficacia antitumorale, mentre l'applicazione di PEMF o del farmaco da solo non ne
aveva. L'efficacia antitumorale dell'elettrochemioterapia della CEMP applicata (480 impulsi
bipolari, alla frequenza di 80 Hz, durata dell'impulso di 340 μs) era presumibilmente dovuta alla
migliore permeabilizzazione della membrana delle cellule nel tessuto, poiché le monoterapie da sole
avevano un effetto molto scarso ma non significativo sulla crescita tumorale rispetto al
controllo. Allo stesso modo, studi preclinici e clinici eseguiti nello schema convenzionale di
elettrochemioterapia con CDDP hanno mostrato una grande efficacia antitumorale
dell'elettrochemioterapia su diversi tipi di tumore 15 , 42 , 59 - 62, principalmente a causa dell'effetto
citotossico diretto sulle cellule tumorali. 60 - 62 È stato dimostrato che dopo l'elettroporazione
convenzionale la citotossicità del CDDP potrebbe essere migliorata di 70 volte. 61 - 63 Tuttavia, nel
nostro studio una sufficiente efficacia antitumorale sul melanoma B16F10 è stata ottenuta con
l'elettrochemioterapia dopo elettroporazione indotta da PEMF, nonostante l'effetto fosse
significativamente inferiore rispetto a quello ottenuto dopo l'elettrochemioterapia convenzionale
con CDDP. Tuttavia, i calcoli suggeriscono che i livelli di campo elettrico sono 4 ordini di
grandezza inferiori a quelli associati all'elettroporazione classica 64, ma tendono ad essere
sufficientemente alti da indurre l'elettroporazione. D'altro canto, mentre si utilizza un campo
elettrico al di sotto di 0,09 V/cm nella posizione del sito del tumore, sospettiamo che non vi sia stata
alcuna possibilità di elettroporazione irreversibile o effetto termico, come ottenuto a un campo
elettrico molto più elevato indotto da PEMF (fino a 40 V /cm). 38 Ancora di più, ipotizziamo che il
PEMF possa essere migliorato posizionando il tumore verso il bordo della bobina, dove in base ai
calcoli si potrebbe ottenere la massima intensità del campo magnetico, che di conseguenza potrebbe
indurre una maggiore intensità del campo elettrico e quindi anche più cellule potrebbe essere
elettroporato con successo in parti più profonde del tessuto tumorale. Pertanto, sono giustificati
ulteriori studi per ottimizzare il PEMF.
